Methylation of p16 ink4a promoter is independent of human papillomavirus DNA physical state: a comparison between cervical pre-neoplastic and neoplastic samples

BACKGROUND Epigenetic modifications in host cells, like p16 ink4a methylation, have been considered as putative complementary mechanisms for cancer development. Because only a small proportion of infected women develop cervical cancer, other factors might be involved in carcinogenesis, either independently or in association with high-risk human papillomavirus (HR-HPV) infections, including epigenetic factors. OBJECTIVES We hypothesised that p16 ink4a methylation might have a role in cancer development driven by HPV16, mainly in the presence of intact E1/E2 genes. Thus, our objectives were to assess the status of p16 ink4a methylation and the HPV16 E1/E2 integrity in samples in different stages of cervical diseases. METHODS Presence of HPV16 was determined by E6 type-specific polymerase chain reaction (PCR). Methylation status of the p16 ink4a promoter was assessed by methylation-specific PCR in 87 cervical specimens comprising 29 low-grade (LSIL), 41 high-grade (HSIL) lesions, and 17 cervical cancers (CC). Characterisation of E1 and E2 disruption (as an indirect indicator of the presence of episomal viral DNA) was performed by PCR amplifications. FINDINGS We observed a significantly increased trend (nptrend = 0.0320) in the proportion of methylated p16 ink4a in cervical samples during cancer development. Concomitant E1 and E2 disruptions were the most frequent pattern found in all groups: CC (76%), HSIL (54%), and LSIL (73%). No statistically significant differences between p16 ink4a methylation and E1/E2 integrity, in histological groups, was observed. MAIN CONCLUSIONS There was an increase in methylation of the p16 ink4a promoter from pre-neoplastic lesions to cancer. Additionally, a high frequency of E1/E2 disruptions in LSIL/HSIL suggested that viral DNA integration was an early event in cervical disease. Moreover, the methylation status was apparently independent of HPV16 integrity.

Evaluation of anogenital human papillomavirus infection in asymptomatic men from Rio de Janeiro, Brazil

Infection by human papillomavirus (HPV) is among the most prevalent sexually transmitted diseases worldwide. However, there are still gaps in the knowledge regarding the natural history of HPV infection in men. This study aimed to determine the prevalence of HPV infection in penile swab samples, derived from a clinically asymptomatic male population. For this purpose, 261 samples were collected between January 2011 and July 2013 in different institutions in the city of Rio de Janeiro. These samples were collected from the glans, corona, frenulum and coronal sulcus of the penis. Viral identification was made through generic and type-specific Polymerase Chain Reaction, and Restriction Fragment Length Polymorphism techniques. Prevalence of HPV infection was 16.5% (43 subjects). The most prevalent HPV type was HPV6 (34.9%), followed by HPV16 (23.3%), HPV11 (16.3%), HPV45 (9.3%) and HPV58 (2.3%). Hence, infection was associated with low-risk oncogenic types in 53.7% of the studied individuals, while high-risk oncogenic types were detected in 46.3%. Statistically significant results were found for the group of men who have sex with men, the group who have active anal intercourse, and subjects that lacked circumcision. After adjustments, sexual behavior and lack of circumcision remained as independent risk factors for HPV infection. We believe that these results may contribute to a clearer view about the circulation of HPV in the general male population, as well as to the identification of risk factors associated with the epidemiology of HPV infection in our state.

Human papillomavirus infection inhealthy men from Rio de Janeiro, Brazil / Infecções por papilomavírus humanos em homens saudáveis do Rio de Janeiro, Brasil

Genital infections by human papillomavirus (HPV) are the most prevalent sexually transmitted viral diseases worldwide. Although the naturalhistory of cervical cancer is better understood, there are still scarce information regarding the etiology of penile cancer, and the natural history of HPV infection in men is not yet fully elucidated. Objective: This study aimed to determine the prevalence of HPV infection in penile samples, from a clinicall yasymptomatic male population. Methods: A total of 550 samples were collected between January 2011 and July 2014 in different institutions in the Stateof Rio de Janeiro, including a dermatology clinic and a metallurgical company. The samples were collected from the anatomical regions of the glans andbalanopreputial sulcus. HPV identification was made through the generic and type-specific Polymerase Chain Reaction (PCR), and Restriction FragmentLength Polymorphism (RFLP) techniques. Results: An overall prevalence of HPV infection was observed in 21.8% (120 subjects). The most prevalent HPV type was HPV 6 (35%), followed by HPV 16 (20.8%), HPV 11 (19.1%), HPV 31 (6.7%), HPV 33 (6.7%), HPV 45 (8.3%) and HPV 58 (3.3%). Hence,infection was associated with low-risk oncogenic types in 54.1% of the studied individuals, while high-risk oncogenic types were detected in 45.9% ofthem. The age of the studied subjects ranged from 18 to 65 years with a mean age of 28.4 years. Conclusion: According to our findings, we can infer thatthe prevalence of HPV infection among asymptomatic male population was considerably lower than the described in the literature, although in agreementwith results reported in some recently published studies. We believe that the results may contribute to understand the features of circulation of HPV in malepopulation, in order to evaluate risk-benefits and strategies of disease prevention.

As infecções genitais pelo Papilomavírus humano (HPV) são hoje as mais prevalentes viroses de transmissão sexual em todo o mundo. Embora a história natural do câncer cervical seja melhor compreendida, pouco se sabe sobre a etiologia do câncer de pênis e a história natural do HPV no homem não está completamente elucidada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo, determinar a prevalência do HPV em amostras penianas de uma população masculina assintomática. Métodos: Foram coletadas 550 amostras entre janeiro de 2011 e julho de 2014 em diferentes instituições do Estado do Rio de Janeiro, dentre elas:uma clínica de dermatologia e uma indústria metalúrgica. As amostras foram coletadas de sítios anatômicos como sulco balanoprepucional. A identificação do HPV foi feita pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) genérica e tipo-específica, bem como pelo Polimorfismo do padrão de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). Resultados: A prevalência total da infecção pelo HPV foi de 21,8% (120 indivíduos). O tipo viral de maior prevalência foi o HPV 6 (35%),seguido pelo HPV 16 (20,8%), HPV 11 (19,1%), HPV 31 (6,7%), HPV 33 (6,7%), HPV 45 (8,3%) e HPV 58 (3,3%). A infecção foi majoritariamente associada a tipos de baixo risco oncogênico (54,1%), enquanto os genótipos oncogênicos foram detectados em 45,9% dos pacientes. A idade dos pacientes variou de 18 a 65 anos com média de 28,4. Conclusão: De acordo com nossos achados, podemos sugerir que a prevalência do HPV na população masculina assintomática foi consideravelmente menor do que a descrita em alguns estudos da literatura, mas em acordo com o reportado recentemente por vários autores. Acreditamos que estes resultados podem contribuir para a compreensão dos aspectos epidemiológicos associados à infecção no trato genital masculino, a fim de avaliar estratégias de prevenção de doenças associadas e avaliar o risco-benefício das diferentes abordagens aplicadas em Saúde-Pública.

Human papillomavirus infection in multiple sites / Infecção por papilomavírus humano em múltiplos sítios

Studies concerning human papillomavirus natural history have been focused on cervical infection and disease, but have scarcely describedanal infections, especially in clinically health population. Hence, knowledge on HPV natural history is recently being investigated although viral maintenance in hosts is poorly understood. Detection on diverse, extragenital sites may add in the elucidation of infection-dissemination-reinfection cycle reported onthe human genital tract. Besides that, it is evident the importance of an adequate screening of the viruses for appropriate diagnosis, mainly in the first steps of the neoplasia in order to provide a better prognosis. Our results pointed out HPV prevalence rates in genital lesions of 87% (80/92) and of 47.8%(44/92) for anal samples. We pointed out that this high prevalence is due to clinically detected lesions, that contributes to the risk of extragenital infections,mainly by host auto-inoculation. Despite the difference in samples size, we did not find statistical relevant differences related with genera (men 85.1% and women 92%; p>0.05), corroborating the idea of no tropism differences by sex. Never heless, for anal samples, statistically significant differences werefound between men and women (68% of anal HPV infection in women against 40.3% in men (p=0.038). These results reveal that female anal infections are more frequent than in men, suggesting that infection by auto inoculation occurs and can render this site as an HPV reservoir, occasionally becoming clinical lesions. Hormonal profile, sexual behavior and differences among body sites can explain these differences here described. Our study is a preliminaryevaluation of HPV infection in human multiple sites.

Muitos estudos sobre a história natural do papilomavírus humano (HPV) têm focado nas infecções cervicais, mas pouco tem se falado sobre infecções anais em pacientes assintomáticos. Assim, a história natural do HPV ainda está em construção e os mecanismos de manutenção dele no organismo hospedeiro são pouco compreendidos. Entendemos que a detecção do vírus em sítios extragenitais poderá ajudar na compreensão da cadeia de infecção disseminação-reinfecção pelo HPV no trato genital humano. Além disso, é evidente a importância de um rastreio adequado do vírus diante de diagnósticos clínicos, principalmente no período inicial da lesão, provendo, assim, um melhor prognóstico. Nossos resultados apontaram uma prevalência da infecção por HPV em lesões genitais de 87% (80/92) e nas amostras anais tal prevalência foi de 47,8% (44/92). Ressaltamos que nossa prevalência foi alta, mas estudamos indivíduos com lesões genitais clinicamente detectadas, aumentando, assim, o risco de infecção em outros sítios e confirmando a ocorrência da presença do HPV no hospedeiro, provavelmente decorrente de autoinoculação. Apesar da diferença entre o número de indivíduos dos sexos feminino e masculino em nosso estudo, não encontramos diferenças estatísticas relacionadas à presença do HPV em lesões genitais (H: 85,1% e M: 92%; p>0.05),corroborando que não há diferenças entre o tropismo por gênero referente às infecções genitais. Entretanto, no caso das infecções anais, a porcentagem foi estatisticamente diferente: 68% de HPV anal em mulheres e 40,3% em homens (p=0,038). Estes resultados apontam que a aquisição da infecção anal em mulheres, apesar de assintomática, é mais frequente do que em homens, sugerindo que esta mucosa possa ser infectada por autoinoculação e funcionar como um reservatório feminino, o que eventualmente poderá resultar em lesões. Tais discrepâncias da prevalência entre homens e mulheres poderiam se explicadas pelo comportamento sexual, por efeitos hormonais e por diferenças entre sítios. Nosso estudo se trata de um levantamento preliminar da infecção por HPV em múltiplos sítios.

An upward trendiin dna p16ink4a methylation patern and high risk hpv infectionn according to the severity of the cervical lesion / Padrão de metilação do gene P16INK4A e de infecções por HPV de alto risco acompanham a evolução de lesões cervicais

SUMMARY High-risk human papillomavirus (hr-HPV) infection is necessary but not sufficient for cervical cancer development. Recently, P16INK4A gene silencing through hypermethylation has been proposed as an important cofactor in cervical carcinogenesis due to its tumor suppressor function. We aimed to investigate P16INK4A methylation status in normal and neoplastic epithelia and evaluate an association with HPV infection and genotype. This cross-sectional study was performed with 141 cervical samples from patients attending Hospital Moncorvo Filho, Rio de Janeiro. HPV detection and genotyping were performed through PCR and P16INK4A methylation by nested-methylation specific PCR (MSP). HPV frequency was 62.4% (88/141). The most common HPV were HPV16 (37%), HPV18 (16.3%) and HPV33/45(15.2%). An upward trend was observed concerning P16INK4A methylation and lesion degree: normal epithelia (10.7%), low grade lesions (22.9%), high grade (57.1%) and carcinoma (93.1%) (p < 0.0001). A multivariate analysis was performed to evaluate an association between methylation, age, tobacco exposure, HPV infection and genotyping. A correlation was found concerning methylation with HPV infection (p < 0.0001), hr-HPV (p = 0.01), HSIL (p < 0.0007) and malignant lesions (p < 0.0001). Since viral infection and epigenetic alterations are related to cervical carcinoma, we suggest that P16INK4A methylation profile maybe thoroughly investigated as a biomarker to identify patients at risk of cancer. .

RESUMO É reconhecido que infecções por papilomavírus humanos de alto risco (HPV) são causa necessária, mas não suficiente para o desenvolvimento do câncer cervical. Recentemente, estudos de silenciamento gênico apontaram que a hipermetilação do gene p16INK4A é importante co-fator para a carcinogênese cervical, eliminando a função supressora de tumor da proteína p16 em lesões malignas. Entretanto poucos estudos avaliaram a relação da metilação com a progressão da doença. Nosso objetivo foi investigar o padrão de metilação do gene P16INK4A em diferentes graus de lesão cervical e sua associação com a infecção por diferentes tipos de HPV. Nosso estudo de corte transversal avaliou 141 amostras cervicais de pacientes atendidas no Hospital Moncorvo Filho, Rio de Janeiro. A detecção e tipagem do HPV foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), e a metilação do gene P16INK4A pela PCR-metilação específica em formato nested (MSP). A frequência de HPV foi de 62,4% (88/141). O tipo mais prevalente foi o HPV16 (37%), seguido pelo HPV18 (16,3%) e HPV33/45 (15,2%). Curva ascendente foi observada quanto ao padrão de metilação do gene P16INK4A e o grau da lesão: a metilação foi identificada em somente 10,7% das amostras de epitélio normal, em 22,9% das lesões de baixo grau, em 57,1% das lesões de alto grau e em 93,1% dos carcinomas (p < 0,0001). Foram feitas análises univariada e multivariada a fim de correlacionar metilação, idade, exposição ao tabaco, infecção e genótipo de HPV. Foi encontrada correlação da metilação com a infecção pelo HPV (p < 0,0001), genótipos de alto risco (p = 0,01), ...

Analysis of molecular biology techniques for the diagnosis of human papillomavirus infection and cervical cancer prevention

The objective of the present study was to evaluate the usefulness of molecular methodologies to access human papillomavirus genome in the genital tract. Samples from 136 women aged 17 to 52 years old obtained from the Dr. Sérgio Franco Laboratories between 2000 and 2001, were analyzed by the hybrid capture assay and amplified by PCR with generic primers MY09/MY11 and specific primers for types 16, 18, 31, 33, 35, 58. Viral genome was detected in 71.3 percent of the samples by hybrid capture and 75 percent by amplification. When cytopathology was used as a reference method for screening lesions, hybrid capture (p=0) and amplification (p=0.002) presented positive association. The 3 methods showed absolute agreement when cytopathology confirmed papillomavirus infection and high grade intraepithelial lesion. Disagreements occurred for 10 cases: seven inflammatory cases positive by PCR and negative for hybrid capture and 3 low squamous intraepithelial lesions positive for hybrid capture but negative for amplification. In conclusion, hybrid capture was shown to be sensitive and specific enough for use in clinical routines. Moreover, the evaluation of viral load values obtained by this method were shown to be related to the severity of the lesion and merit further studies to analyze the possible association with risk of progression to malignancy.

O objetivo do nosso trabalho foi avaliar o emprego de métodos moleculares para comprovar a presença dos papilomavírus humanos no trato genital. Amostras de 136 pacientes com idades entre 17 e 52 anos, coletadas nos Laboratórios Dr. Sérgio Franco entre 2000 e 2001, foram analisadas pelas técnicas de captura híbrida e amplificação pela reação em cadeia da polimerase com primers genéricos MY09/MY11 e específicos para os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 58. O genoma viral foi detectado em 71,3 por cento dessas amostras pela captura híbrida e 75 por cento pela reação em cadeia da polimerase. Quando a citopatologia foi usada como método de referência para rastreamento das lesões, a captura (p=0) e a amplificação (p=0,002) demonstraram associação positiva. Os três testes demonstraram concordância absoluta quando a citopatologia diagnosticou processo compatível com papilomavírus ou lesão intraepitelial de alto grau. Dez casos discordantes ocorreram: sete casos de citologia inflamatório positivos na reação em cadeia da polimerase mas negativos na captura híbrida e 3 casos de lesão de baixo grau positivas na captura híbrida e negativas pela reação em cadeia da polimerase. Concluímos que a captura híbrida apresentou sensibilidade e especificidade adequadas para uso clínico. Avaliação da carga viral obtida por esta metodologia relacionou-se com a severidade da lesão e merece estudos adicionais a fim de determinar seu valor prognóstico para o câncer.

Comparação entre a técnica de captura do híbrido e a reação em cadeia da polimerase na detecção de infecções causadas por papilomavírus humanos no colo do útero / Comparison of the hybrid capture technique and the polymerase chain reaction for the detection of human papillomavirus infections of the cervix

As infecções causadas pelos Papilomavírus humanos (HPV) são as doenças Sexualmente Transmissíveis mais frequentes em todo mundo. Cerca de 30% destas infecções são persistentes, fato associado ao aumento significativo do risco de neoplasia cervical. Assim, o acompanhamento das infecções persistentes, associadas ao HPV de alto risco, funcionaria como medida preventiva contra o câncer. Por esta razão, entra em discussão qual a melhor técnica de detecção da infecção e estreamento das pacientes...A carga viral obtida pela HCAII mostrou uma média crescente até as lesões de baixo-grau (LSIL) e uma queda nas lesões de alto-grau, mas de modo geral, a análise foi inconclusiva, apresentando valores com significância estatística somente para as LSIL. Considerando o custo ainda elevado destas duas técnicas, as implicações na prevenção e no tratamento das infecções pelo HPV, concluímos que tanto a HCAII como a PCR podem ser utilizadas justamente com a Citopatologia (Papanicolau), que já é o exame de eleição para o rastreamento das pacientes, direcionados principalmente para mulheres acima dos 35 anos de idade. Isto porque, acima desta idade há um aumento das chances de estarmos frete às infecções persistentes, que constituem o principal fator de risco para a carcinogênese. Sendo assim, o uso combinado poderia significar medida mais efetiva de prevenção contra o câncer cervical.